RIG-I 配體

• 5’ppp-dsRNA

5’ppp-dsRNA 是一種5’三磷酸雙鏈RNA，通過一個由19個核酸分子通過磷酸二酯鍵聚合成的5`三磷酸單鏈RNA和其非三磷酸互補鏈雜交形成。5’ppp-dsRNA的序列可以通過篩選各種序列突變體確定。未加帽的5’三磷酸雙鏈RNA能夠被RIG-I特異性識別。

• 3p-hpRNA

3p-hpRNA是通過體外轉(zhuǎn)錄甲型流感病毒（H1N1）序列而產(chǎn)生的5’三磷酸發(fā)夾RNA。這個有87個核酸分子的RNA寡核苷酸含有未加帽的5`三磷酸酯末端和雙鏈片段，它們是RIG-I識別的特征結(jié)構(gòu)。3p-hpRNA是RIG-I的一種有效并特異性的激動劑。

RIG-I/MAVS 報告基因細胞

InvivoGen欣博盛生物提供一系基于人源肺癌細胞株A549，小鼠巨噬細胞RAW和人源胚腎細胞HEK293穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系，助力RNA感受器RIG-I信號通路的研究。這些細胞系包括RIG-I或MAVS基因的敲除細胞株（衍生自A549或RAW細胞系）或者RIG-I基因的過表達細胞株（衍生自HEK-293細胞系）。

描述

所有的RIG-I/MAVS報告基因細胞系均表達一個含有分泌型熒光素酶基因ISG（干擾素刺激基因）誘導(dǎo)型構(gòu)件?；罨疪IG-I/MAVS信號通路可誘導(dǎo)ISG啟動子的活化并產(chǎn)生熒光素酶，該酶存在于細胞上清并能夠通過熒光素酶檢測試劑QUANTI-Luc™檢測定量。源于A549的細胞攜帶一個額外的NF-κB誘導(dǎo)表達分泌型堿性磷酸酶（SEAP）基因構(gòu)件，該酶的活性能夠通過SEAP檢測試劑QUANTI-Blue™檢測定量。

這些RIG-I/MAVS報告基因細胞株攜帶Zeocin™單抗性基因或Zeocin™和Blasticidin（參見最后一頁）雙抗性基因。

結(jié)果

使 用 RIG-I激動劑，復(fù)合了 LyoVec™的 5’ppp-dsRNA和3p-hpRNA刺激A549-Dual™和RAW-Lucia™ ISG細胞系，ISG應(yīng)答顯著。在A549-Dual™細胞中3p-hpRNA激動性強度明顯高于5’pppdsRNA，30 ng/ml的3p-hpRNA復(fù)合物活化信號已明顯高于300 ng/ml 5’ppp-dsRNA的復(fù)合物。相反，在RIG-I-KO或MAVS-KO細胞株中應(yīng)答消失。使用RIG-I配體刺激HEK-Lucia™對照細胞時ISG反應(yīng)很弱。而在HEK-Lucia™ RIG-I細胞中，由于RIG-I基因的組成型過表達導(dǎo)致這種應(yīng)答尤為強烈。同樣，當(dāng)使用3p-hpRNA和5’ppp-dsRNA時觀察到更高水平的ISG應(yīng)答。在衍生自A549的細胞株中NF-κB對于RIG-I配體的反應(yīng)跟ISG應(yīng)答是相似的，雖然前者更弱一些（參考網(wǎng)站數(shù)據(jù)）。

ISG對RIG-I配體的反應(yīng)：使用300 ng/ml的5’ppp-dsRNA或30 ng/ml的3p-hpRNA刺激衍生自A549的細胞；使用1 μg/ml 5’ppp-dsRNA或3p-hpRNA刺激衍生自RAW和HEK293的細胞。經(jīng)過孵育過夜，可使用QUANTI-Luc™檢測上清中Lucia熒光素酶活性的相對光單位（RLUs）以測試ISG的反應(yīng)。

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